染料法熒光定量PCR試劑盒前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以?xún)?nèi)
1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：
ΔCT（test）=CT（target,test）-CT（ref,test）
ΔCT（calibrator）=CT（target,calibrator）-CT（ref,calibrator）
2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值：
ΔΔCT=ΔCT（test）-ΔCT（calibrator）
3、計(jì)算表達(dá)水平比率：
2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值
使用方法:
一、稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）
1.注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染原，本產(chǎn)品不提供樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以鐘使用的DNA段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯頭分別加入45μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯頭，下同）。
4.在7號(hào)管中加入5μL 1×10E8拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5.換頭，在6號(hào)管中加入5μL 1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6.換頭，在5號(hào)管中加入5μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
具有下列特點(diǎn)：
1.根據(jù)指標(biāo)的保守序列設(shè)計(jì)的專(zhuān)一性引物，余關(guān)無(wú)交叉反應(yīng)。
2.靈敏度比常規(guī)PCR高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
3.即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供樣品模板，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確快速。
4.一管式熒光定量PCR檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨診斷。
需要自備的器材：
1．儀器：分析天平、離心機(jī)、熒光PCR擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2μL、20
μL、200μL、1000μL）。
2．耗材：熒光PCR反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL經(jīng)焦碳二謠（DEPC）水
處理的滅菌離心管、吸頭（10μL、200μL、1000μL）、滅菌雙蒸水。
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